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蛋白结合与吸附 | 下篇

2022-07-16

在生物材料的相容性研究中,蛋白质与材料表面的相互作用极其关键,一直是研究的重点之一。

吸附的动力学、构象变化和变性

1980年前后,研究人员发现蛋白质吸附是不可逆的,他们认为这种不可逆性是由多个附着在表面的位点引起的,且蛋白的活性在吸附后显着降低。现在研究发现蛋白质吸附发生有两种情况:可逆吸附和不可逆构象变化。第二种情况有一个著名的例子是BSA(牛血清白蛋白)的侧面和端部构象,这最初被认为是由简单的方向变化引起的,但现在已知是通过蛋白的展开。下图显示了BSA构象变化的示意图,该蛋白质吸附结果是不可逆的。

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材料表面特性对吸附的影响

根据前面介绍的离子/静电相互作用和疏水相互作用,就可以对材料表面性能,对蛋白吸附做出评估。

常用的PBS缓冲液pH 7.4,如果蛋白的PI小于7.4,在此条件下蛋白呈阴性,如果材料含氨基,表面就有正电性。蛋白就会通过静电相互作用吸附在表面。如果材料含氨基,表面就有正电性。在PBS缓冲液pH 7.4环境中,PI小于7.4 的正电性蛋白,就会被表面就会排斥,减少表面吸附。

非极性材料表面对于蛋白的具有显著的吸附作用。这些材料包括聚苯乙烯、硅胶材料、聚氯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等大量合成材料,以及这些材料和长碳链脂 肪族涂敷的表面聚苯乙烯制成的 96 孔板通过表面非极性吸附用来固定抗体,从而进行ELISA 定量检测蛋白。非极性医疗器材表面的蛋白吸附,是造成雪凝的主要原因之一。

极性的,交联后的水溶性高分子,如葡聚糖、聚丙烯酰胺、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸羟乙酯,则具有较少的蛋白吸附。这些高分子也经常被用来共聚成材,或表面涂层,以减少蛋白吸附。采用反相表面聚合技术在强非极性的医用硅胶 (Silastic®) 和中等非极性的医用聚氨酯 (Tecoflex®) 表面接枝聚合亲水性高分子涂层后,置于在不同浓度的纤维蛋白原(Fibrinogen)的溶液中,通过放射性同位素标记来检测表面纤维蛋白原吸附。涂层对表面吸附都有了显著降低。

减少蛋白吸附的的方法

对于现有不能做表面改性的材料表面,为减少蛋白吸附,特别是干扰蛋白检测或分离过程中的非特异结合NSB,常见的办法包括:

1.调整缓冲液的pH值。

2.使用蛋白质封闭添加剂。

3.添加非离子表面活性剂。

4.增加盐浓度。

为了选择最佳方法,了解分析物和配体的特性非常重要。了解分子的等电点、电荷、大小和组成(亲水性、疏水性)可以帮助确定在实验中减少NSB的最有效条件。

1. 调整缓冲液的pH值

缓冲液的pH值会对NSB产生重大影响,因为它决定了生物分子的总电荷(正或负)。例如,如果使用的pH值使的分析物带正电,分析物将与带负电的表面发生非特异性相互作用。在这种情况下,可以选择将缓冲液调整到蛋白质等电点范围(预测的中性总电荷)内的pH值,或中和表面静电。

2. 为增加特异性结合检测,使用缓冲添加剂——蛋白质阻滞剂

防止非特异性结合的良好第一步是将牛血清白蛋白 (BSA),一种常用的蛋白质封闭添加剂,添加到缓冲液和样品溶液中。作为由具有不同电荷密度的域组成的球状蛋白质,BSA可以围绕着检测蛋白,以保护其免受非特异性蛋白质-蛋白质相互作用、与带电表面或非极性表面的相互作用。因此,可以使用BSA等添加剂将NSB降至Z低。

3. 添加表面活性剂——吐温 20

如果由于系统中的疏水相互作用而发生非特异性结合,使用非离子表面活性剂(例如Tween 20)可能会有所帮助。低浓度吐温20会降低蛋白和非极性表面之间的疏水相互作用。

4. 增加盐浓度

在主要由于基于电荷的相互作用而发生 NSB 的系统中,在缓冲液中使用更高的盐浓度可以通过对分析蛋白产生屏蔽效应来减少这些相互作用。可以使用不同浓度的盐类(例如NaCl)来防止带电蛋白质与其他带电表面的相互作用。

作者

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王国斌,美籍华人博士,在生命科学和表面化学领域有着20多年的产品研发经验。曾就职于SRU Biosystems,开发了 BIND™生物传感器,现就职于BMT Biosystems,任副总裁,管理生物医学和诊断产品中特殊材料及表面应用的开发和生产。

王国斌博士凭借在高分子化学、表面科学、蛋白质兼容表面等方面的丰富经验,在加入月旭科技后,主持研制了“续净一号"银离子消毒液,并对月旭科技的蛋白纯化系列产品的研发提供了极大的技术支持。为今后月旭科技在生命科学领域的发展注入一剂强心针。